除了基因敲除、堿基編輯，提升基因功能是否還有其他的全新路徑?中國農(nóng)業(yè)大學植物保護學院姜臨建與青島清原化合物有限公司李華榮、中科院分子植物科學卓越創(chuàng)新中心朱健康、貴州大學宋寶安等研究人員開展合作，報道了一種“基因敲高”的新策略。

研究人員表示，這項研究進一步深化了對基因編輯工具的認知和理解?；蚓庉媱?chuàng)制基因組結構變異是以自然為師。“基因敲高”有望成為基因編輯技術在動植物育種上應用的新領域。

第三大應用場景

以CRISPR/Cas9為代表的基因編輯技術能夠在基因組上產(chǎn)生精準突變，為動植物育種提供了革命性工具。由于基因編輯的最終產(chǎn)品不含外源基因，并且也可以通過傳統(tǒng)誘變或自然突變獲得，因此基因編輯作物在很多國家被視為普通品種。在美國上市的高油酸大豆、在日本上市的高γ—氨基丁酸番茄等，都是基因編輯產(chǎn)品作為常規(guī)品種推廣的案例。

論文通訊作者姜臨建介紹，目前，通過基因編輯技術來精準誘變基因的應用主要集中在兩個場景：一是對基因敲除，這是目前基因編輯在育種方面最普遍的應用。上述大豆和番茄就是基因敲除的兩個例子。二是對基因進行點突變，即通過堿基編輯提升基因功能。已在美國推廣種植的抗ALS除草劑油菜就是通過堿基替換，使內(nèi)源ALS基因獲得了抗除草劑的新功能。隨著堿基編輯技術的快速發(fā)展，該領域的應用正日益深入。

“鑒于大量的基因通過提升其表達量即可帶來性狀的改良，因此基因敲高(即上調(diào)基因表達)是與基因敲除、堿基編輯提升基因功能并列的第三大應用場景。”姜臨建說。

上調(diào)基因表達的通用技術路線是在目標基因附近插入調(diào)控元件，例如強啟動子、增強子等，從而提高目標基因的表達水平。但是，由于插入整合了人工DNA，在推廣應用方面可能會面臨嚴格的監(jiān)管。很顯然，如果能夠在不插入人工DNA的前提下實現(xiàn)上調(diào)基因表達，將在推廣應用方面更具優(yōu)勢。不過，傳統(tǒng)觀點認為該技術路線很難實現(xiàn)。

“敲高”水稻內(nèi)源基因

由于轉基因過表達水稻PPO1和HPPD就能夠分別帶來對兩種專利除草劑(中國自主知識產(chǎn)權)的抗性，該研究的核心問題是，如何在不整合人工合成DNA(作為強啟動子)的前提下，利用基因編輯技術大幅“敲高”這兩個基因的表達。

許多研究很早就發(fā)現(xiàn)，Cas9同時在一個基因的不同位置切割時，會造成刪除、倒位、重復等基因組結構變異。研究團隊突然意識到，只要在所要上調(diào)表達的目標基因附近找到高表達基因并選擇恰當?shù)奈稽c切割，就能夠創(chuàng)造出特定的結構變異，將高表達基因的啟動子與目標基因相連接，形成新的基因表達模式，從而大幅“敲高”目標基因的表達。

據(jù)此，研究團隊根據(jù)水稻轉錄組信息，分別在PPO1和HPPD附近找到了高表達基因CP12和Ubiquitin2，并采用相關設計，構建了雙靶點CRISPR載體對水稻愈傷進行了大規(guī)模轉化，成功在水稻植株中創(chuàng)制了兩種不同且可以穩(wěn)定遺傳的基因組結構變異。

在被成功編輯的水稻植株中，CP12基因的啟動子驅動PPO1基因的表達，Ubiquitin2基因的啟動子驅動HPPD基因的表達，從而大幅“敲高”了水稻內(nèi)源PPO1和HPPD基因，使水稻植株表現(xiàn)出預期的抗除草劑性狀。

作者表示，抗除草劑品種配合高效的專利除草劑，有望為水稻田雜草防控提供更加高效的解決方案。

有望成為基因編輯技術新領域

長期以來，Cas9一直被作為基因敲除工具，而點突變及上調(diào)基因表達通常需要插入人工DNA模板，這是對基因編輯工具的傳統(tǒng)認知。

之前，該團隊開發(fā)了“循環(huán)打靶”堿基編輯策略，通過雙靶點的“循環(huán)打靶”設計將Cas9變成了全功能的堿基編輯器。此次研究中，團隊設計了能夠上調(diào)基因表達的倒位、重復等基因組結構變異，成功實現(xiàn)了對目標基因的敲高。

姜臨建表示，這意味著無需人工DNA模板，Cas9不僅能夠敲除基因，還可以創(chuàng)制點突變和敲高基因，是名副其實的全功能基因及基因組編輯工具。該研究進一步深化了對基因編輯工具的認知和理解。

隨著長片段測序技術的發(fā)展，在基因組層面上比較不同品種之間的差異成為可能，“泛基因組學”方興未艾。大量泛基因組學研究表明不同品種之間存在大量結構變異。一些重要的農(nóng)藝性狀就是基因組結構變異的結果。例如，蟠桃和圓桃之間的果型差異是由桃基因組上大片段的倒位導致的;水稻基因組上特定片段的重復能夠影響秈粳雜交稻的育性。

由此，作者認為，基因組結構變異是物種演化的重要推動力，是自然界中的普遍現(xiàn)象。通過基因編輯技術創(chuàng)制預期的結構變異，是以自然為師而已。

改變基因的表達模式是動植物遺傳改良的重要方面，但長期以來主要依靠插入人工DNA來實現(xiàn)。這項研究提供了改變基因表達模式(尤其是敲高基因)的通用方法，不需要插入人工DNA，有望開辟基因編輯技術在動植物育種上應用的新領域。(記者 王方 通訊員 何志勇)

標簽： 師法自然 基因敲除 堿基編輯 基因功能